結核菌群螢光分子鑑別檢測

技術摘要

結核病(Tuberculosis, TB)是臺灣法定傳染病之一，仍然是全球公共衛生之重大威脅。結核病係經由空氣傳播結核菌群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTBC)感染所致。結核菌群中包括臨床及公共衛生上，重要之結核菌(M. tuberculosis)、牛型結核菌(M. bovis)及卡介苗株(M. bovis BCG)等。除結核菌外，牛型結核菌是重要之人畜共通傳染病，除對人及動物之健康影響甚劇，亦對相關經濟活動造成威脅，且牛型結核菌對pyrazinamide具先天抗藥性，可能同時對isoniazid及rifampicin抗藥，因為常造成肺外之病灶，診斷不易。未加以即時鑑別會造成治療照護之挑戰，病人癒後可能不佳。至於卡介苗株之鑑定，有助於疫苗上市後副作用及膀胱癌治療監測。

由於結核病之細菌病原檢測需耗時數週，曠日費時。且世界衛生組織推薦之標準臨床檢測方法，只能判定至結核菌群，且有檢體適用類別及檢測極限(detection limit)等問題。例如：側向流量免疫層析檢測(lateral flow immunochromatographic test, ICT)方法，有敏感度低及偽陰/陽性問題，恐造成病患延遲及/或錯誤診療，並導致結核病持續傳播。而本分子生物方法技術係利用專一性序列引子及螢光標定探針，進行即時聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction, PCR)。除可快速檢測結核菌群外，並且可同步鑑別牛型結核菌及卡介苗株，具有高度檢驗敏感性與最佳時效性。

技術內容

臺灣每年確診結核病個案約80%具有細菌學檢驗結果。一般常規臨床實驗室執行結核病細菌學檢驗至少包含6項目：傳統抗酸菌塗片顯微鏡檢查、分枝桿菌培養、菌種鑑定、抗藥性試驗、分子生物核酸增幅試驗(nucleic acid amplification test, NAAT)及基因分型。其中，菌種鑑定可採用傳統之生物化學鑑定法，耗時及判讀困難。部分臨床實驗室改採用基質輔助雷射脫附游離飛行時間(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight, MALDI-TOF)質譜儀技術，以鑑別培養後細菌。其分析原理乃針對細菌本身之結構性蛋白質，以質量偵測後與資料庫進行比對，仍因前處理步驟複雜及資料庫完整性而仍有其限制。現行廣為運用之標準化免疫層析檢測(immunochromatiographic test, ICT)，其原理是透過偵測特定抗原，檢測結核菌群。雖可於15分鐘內完成結果判讀，缺點是須在高生物安全等級實驗室內執行，且無法鑑別結核菌群中其他菌種。另，考量方法學限制，須注意檢測之偽陰性結果，須再以分子生物方法及參考細菌的型態進行綜合研判，以完成最後鑑定。例如：當結核菌群菌量少於105CFU，或當檢體內含不具有目標抗原之結核菌群(如：牛型結核菌等)，可能造成偽陰性；當檢體存在Mycobacterium gastri及Mycobacterium fortuitum時，ICT可能有偽陽性。現有商用NAAT則透過PCR，可快速偵測臨床直接檢體中之結核菌群，雖具良好敏感度，但需注意僞陽性問題。且對於抗酸菌塗片鏡檢結果為陰性之檢體，敏感度較差。重要的是，多數商用平台不適用於菌株檢測，所得結果僅能供參考用，且現有商用檢測試劑及平台皆相當昂貴。

爰此，為優化結核菌鑑定及加強鑑別牛型結核菌/卡介苗株，本技術利用分子生物方法，依據結核菌群之專一性插入序列(insertion sequence, IS)及M. bovis family特定RD序列等，分別設計三組特異性引子及螢光探針，於同一反應管中，進行即時PCR：藉由螢光分別呈現三組特異性序列之擴增程度，以判別待測檢體中，是否有含結核菌群核酸，並可同步檢測牛型結核菌及卡介苗株核酸。本技術可快速鑑定結核菌群，具高度檢測敏感性與報告時效性，且可彈性設計以適用於小量檢體檢驗及大量檢體之篩檢，而可廣泛應用於臨床檢驗、公共衛生監測及流行病學調查等範疇。

團隊簡介或技術聯絡人

周如文 博士
電話:(02)8173-5701
Email: rwj@cdc.gov.tw

• 依世界衛生組織最新指引建立試驗方法及監測人畜抗藥性結核病 (2021-2024)
• 健康一體:人畜結核病之監測與基因資料分析 (2020-2022)
• 牛結核桿菌人及動物之檢驗、監測與流行調查 (2017-2019)
• 人感染牛型結核病的快速檢測方法之應用評估 (2015)
• 開發簡易牛型結核病的快速檢測試劑及方法 (2014)

詹岱華
電話:(02)8173-5699
Email: dhc@cdc.gov.tw

王于箴
電話:(02)8173-5704
Email: ych3@cdc.gov.tw