固相式吸附方式富集微生物核酸以快速鑑定微生物與抗藥性的診斷系統

技術摘要

本技術係提供可快速鑑定細菌物種與抗藥基因之核酸樣本製備方法。在血液培養樣本中，經選擇性裂解液破除人類細胞後，採取固相吸附方式移除人類與其它來源之非標的游離核酸，萃取出細菌長片段核酸，藉以富集目標細菌的核酸量。搭配奈米孔定序技術，快速取得細菌核酸序列資料，再經由即時生物資訊分析，快速地鑑定出病原菌的種類與其攜帶之抗藥基因以預測病原菌種及抗藥性。將有助醫師精準選用有效治療藥物，提升菌血症病人治癒率，降低無效用藥並降低抗藥菌株的產生與傳播。

技術內容

全球菌血症與敗血症案例逐年上升以及老年人口、長照人口數的比例增加，再加上血流感染的情況逐漸升高，市場對快速鑑定診斷儀器的需求量增加，以期能在最短的時間內找出病原菌，對「菌」下藥，並盡可能以最快的方式找出病菌抗藥性，安排適合病人的抗生素用藥療程。現行血流感染主要以血液培養、微生物藥物敏感性測試為主要鑑定方式，不但需要較高的人力成本，同時也容易耽誤病人用藥而使病情惡化。所以臨床端對於快速鑑定微生物種類與抗藥性基因的需求也就大增。

然而對於檢測團隊來說，宿主核酸的干擾仍是一個非常棘手的難題。尤其是對總體基因組定序而言，臨床檢體或血液培養物為極具挑戰性的樣本，因其中通常存在大量人類或其他動物的核酸，故僅有少量的序列可用於鑑定微生物種類及抗藥基因。雖可從大量原始數據中過濾掉屬於宿主的序列資料，但由於在定序的過程中，宿主核酸佔據了大部分的的定序通量，使得目標細菌核酸序列的豐度較低，進而導致病原體的檢測靈敏度與精準度降低。

有鑑於此，本團隊開發一套針對以奈米孔定序進行總體基因組定序的血液培養樣本前處理流程。一反傳統上透過核酸酶來移除宿主基因，改為利用物理性較溫和且不殘留的方式吸附並同步移除宿主基因，維持目標病原菌核酸長度並有效移除可能影響定序進行的抑制物。使用Nanopore定序平台，可在15分鐘內利用產生的數據進行比對，占全體讀序1%以上的微生物族群的分佈比例，可作為該樣本中該目標微生物相對豐度的依據。

本團隊更進一步開發微生物抗藥性的預測方法，使用滿足該目標微生物基因組覆蓋深度的定序數據，來鑑定該目標微生物質體上完整的抗藥基因亞型種類與數量以及染色體上的突變位點，從而預測該目標微生物對於抗微生物藥物的抗藥性。而經本團隊經模擬不同種的單一革蘭氏陰性菌及陽性菌種及攜帶29個抗藥基因的克雷伯氏肺炎菌(Klebsiella pneumoniae)摻入血液經血瓶培養後進行模擬試驗。結果顯示，至多6小時奈米孔定序(MinION)時間的產出序列資訊即足夠檢測出完整的抗藥基因。並且經臨床檢體驗證，與全球醫院裝機率最高的病原菌定點照護診斷(POCT)產品Biofire FilmArray BCID2 panel同步進行比較，顯示本技術具備更全面性、敏感度更高、準確性更好且更具成本效益。

本技術與診斷系統目前已申請了台灣、美國等專利。並與醫學中心合作，測試了46個樣本，檢測結果與臨床傳統檢驗結果具高度的一致性。檢測菌種及抗藥基因的時間更可縮短到取得血液培養血瓶後一個工作天(6~10小時)內即可提供醫師抗藥菌株報告。未來此一技術與產品將移轉至產業界進行優化並佈局後續生產製造，朝系統化目標發展，以期研發出更省時、更有效率，降低生產成本的自動化機型。本團隊將持續進行技術的精進與發展，藉由技術商品化所獲得的資金，挹注研究資源，持續改善即時分子診斷之準確性，希望成為能為感染症患者健康把關的精準診斷產品。

傳統培養方法、Filmarry BCID2 模組與本團隊開發技術(TCDC Nanopore-seq)，鑑定菌種與抗藥基因所需之周轉時間比較。

團隊簡介或技術聯絡人

本技術的開發由疾管署邱乾順研究員所帶領的團隊，宋惠詠博士、洪羽屏博士、陳柏翰助理、王佑文助理與中國醫大感染科盧敏吉教授/醫師、湯惠玲博士共同合作開發。團隊長期在國內對於感染症的分子分型監測與方法的建立，以及細菌抗藥性監測與機制、抗生素的治療與機構感染症的預防與管制有著很豐富的研究經驗與成果。

邱乾順研究員
Email: nipmcsc@cdc.gov.tw