最新消息

Events

衛福部研發技術成果快訊-小分子毒素之抗體生產與快速免疫檢測技術之開發

2001-06-08

技術名稱

小分子毒素之抗體生產與快速免疫檢測技術之開發

執行團隊免疫化學暨食品安全快速檢測實驗室(中山醫學大學生物醫學科學系)

技術摘要

特色與說明

本研究室致力於免疫化學分析及食品安全毒理與方面的研究,主要針對食品、榖物及飲水中的小分子黴菌毒素(包括aflatoxin; ochratoxin; fumonisin; zearalenone; citrinin; T2 toxin)、藻類毒素(microcystin; domoic acid; okadaic acid; saxitoxin) 、瘦肉精、抗生素殘留與中草藥的馬兜鈴酸(aristolochic acid)進行毒素單株及多株抗體的生產、酵素免疫分析法的開發應用、抗體奈米金粒子應用於快速免疫層析試紙的開發,其中相關技術分為三類:

技術強項與優勢
  • 單株與多株抗體製備生產

    抗體製備所包含的技術有免疫抗原的製備-小分子化合物與蛋白質化學接合技術、單株抗體製備-融合瘤細胞技術、動物實驗相關技能(兔、小鼠) 及抗體親合層析管柱純化技術。

  • 酵素連結免疫吸附分析法 (ELISA) 開發

    酵素免疫分析法技術開發包括小分子化合物與蛋白質或酵素化學接合技術、ELISA及 ELISA kit 條件優化效期保存及相關操作技能。

  • 快速免疫層析試紙 (Immunochromatographic strip)生產製備,免疫層析試紙開發技術為奈米金粒子合成技術、抗體與奈米金粒子接合技術、免疫層析試紙優化及相關操作技能。

  • 高效液相層析法操作技能及樣品相關萃取技術,樣品分析技術及確効。

開放哪些合作項目

上述所有項目皆可開放

技術內容

小分子毒素之抗體生產

所謂小分子毒素是分子量小於1000道耳吞(dalton, Da)之分子,如黴菌毒素(mycotoxin)和藻類毒素(phycotoxin),其他如馬兜鈴酸、抗生素(antibiotics)和瘦肉精殘留等,如此低分子量的毒素在動物體內並不具有誘發免疫反應的能力,因此必須利用化學耦合反應將小分子毒素接合至載體蛋白質(carrier protein)上形成毒素-蛋白質接合物大分子,才能成為可以進行動物免疫的合適抗原,化學藕合試劑如1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide(EDC)常被用來活化小分子化合物上之羧基(COOH),以利與蛋白質上之胺基(NH2)形成醯胺鍵(amide bond)共價鍵接合在一起。

一般常被使用的載體蛋白質有血藍蛋白質(keyhole limpet hemocyanin; KLH)、小牛血清蛋白(bovine serum albumin, BSA)與球蛋白(-globulin)等,小分子毒素與載體蛋白質的化學接合反應,往往是一個動物抗體及融合瘤是否可以成功產生的重點關鍵;但是必須採用何種化學耦合反應、何種載體蛋白、以及使用多少比例進行接合反應方能成為一個成功的抗原,則視毒素本身的化學結構和官能基的分布而有所不同,因此必須多方嘗試再輔以深厚的經驗才有機會合成出能夠有效誘發專一性抗體的抗原,這種小分子抗體生產方式所需要的技術層次和花費時間,其困難度都遠較生產一般蛋白質抗體要來得高出許多。

抗體是因為體內對外來物質(亦即抗原)產生一系列反應所釋出的一種免疫球蛋白,其主要是由血漿細胞及B淋巴細胞的前驅物所製造而來,抗體循環在血球及淋巴液中,與特定的抗原互相結合,這些抗體-抗原的結合物最終會被巨噬細胞(macrophage)吞噬消滅。由於這種抗體-抗原結合反應的專一性很高,因此抗體是免疫診斷與治療當中至關重要的試劑。常被使用的抗體有兩種,一種是多株抗體(polyclonal antibody),另一種是單株抗體(monoclonal antibody),單株抗體與多株抗體的生產方式並不相同,多株抗體的製造需要使用接合後的抗原以誘發紐西蘭大白兔的免疫反應,由於在動物血清中含有來自不同B細胞株的不同抗體,所以稱之為多株抗體。雖然多株抗體製作的過程相較於單株抗體要來得略為簡單,但卻具有一些缺點,例如來自不同批次所得到的抗血清會缺乏一致性。即使是從同一隻動物體內於不同時期所抽取的抗血清,其對抗原的親和力和專一性亦會有很大的差異。

單株抗體的生產方式,則是利用融合瘤來生產小分子毒素單株抗體,其相當費時而且耗力,經由化學反應純化後的抗原必須花費八至十週免疫小鼠,取免疫過的小鼠脾臟細胞與培養的骨髓瘤細胞(myeloma cell)融合形成融合瘤細胞 (hybridoma cell),再經由一至二個月培養篩選出分泌抗體的細胞株,而且此一細胞株必須穩定分泌出具有高親和性,高專一性以及適合應用在免疫檢驗試劑及層析試紙等商業用途的抗體,若是幸運找到具有潛力的候選細胞株,則至少需再花一個月進行單一細胞選殖和確認,在一切順利的情況下,對任何一個合成抗原至少需要6至8個月的時間才有可能得到高專一性單株抗體,最後的量產則靠注射老鼠產生腹水(約花二至三週),最終經過純化作用才能應用於抗體用量較高的免疫試紙開發。

酵素免疫分析法及快速奈米金免疫層析試紙
a.酵素免疫分析法

酵素免疫分析法(ELISA),其原理為利用抗體與小分子毒素之間的專一性鍵結能力來定量樣品中毒素與抗體的結合率,藉此判斷樣品中毒素的含量,其能夠有效地縮短檢測時間及降低操作的複雜度,並且能夠一次性地檢測大量樣品。

利用酵素免疫分析法分析小分子毒素依照原理可分為兩種,一是直接競爭型酵素免疫分析法(direct competitive ELISA)及非直接競爭酵素免疫分析法(indirect competitive ELISA),一般來說最常用於檢測食品中小分子毒素的方法為直接競爭型酵素免疫分析法,直接競爭型的原理是將抗體吸附於固相微孔盤內,同時加入不同濃度的小分子毒素標準品或待測物與固定量之毒素—酵素接合物,毒素與毒素—酵素物兩者競爭微孔盤內之抗體,游離毒素愈多就會有較少毒素—酵素物鍵結到抗體上,再加入酵素受質來進行呈色反應,毒素愈高顏色愈淺。最後利用免疫分析儀定量呈色之吸光值達到檢測樣品中毒素的含量(圖一)。一般商業化小分子毒素的酵素免疫分析法檢驗試劑(ELISA kit)大多根據此方法製造而來,首先將抗體吸附於盤底,經過阻斷(blocking)及保護液處理後,吸乾溶液再以鋁箔袋真空密封微孔盤,提供毒素標準品溶液、洗盤液、酵素受質、及反應終止液,並藉由調整內容物毒素與酵素接合物濃度,可將完整之免疫分析時間縮短至20~25分鐘左右。

雖然酵素免疫分析法具備敏感度高、花費較化學分析法便宜以及一次可以大量檢測樣品的優點,但仍然需要訓練有素的實驗人員及儀器的檢測,為了簡便、快速地檢測小分子毒素,並且能夠在實驗室以外的地方現場使用,我們進一步利用奈米金粒子(gold nanoparticle)標記抗體來開發快速免疫層析試紙Immunochromatographic strip, immunostrip),此一免疫層析試紙,不需要訓練有素人員及儀器,可以在現場即時檢測食品中小分子毒素的含量。

b. 快速奈米金免疫層析試紙(immunochromatographic strip; immunostrip)

將抗體與紅色奈米金粒子(20~40 nm)相接合為探針,製備快速免疫層析試紙,因為其操作簡單快速,約10分鐘便可以完成檢測,操作人員不需特別訓練即可進行檢測分析,因此是目前檢測小分子毒素最流行的分析方法,其原理主要依據抗體與小分子毒素的高度專一性,抗體與奈米金粒子間彼此結合的親和性,以及紅色奈米金粒子可被肉眼清楚辨識等特性,因此當毒素樣品及抗體與奈米金粒子探針的接合物沿著膜移動並發生鍵結作用後,此免疫試紙可以在10分鐘左右以肉眼判定結果並完成檢測,試紙主要組成份為樣品層、釋放層、硝基纖維膜(Nitrocellulose, NC)以及吸水區;NC 膜上有測試線(T)及控制線(C)及、釋放層上有吸附抗體與奈米金粒子探針的接合物,測試線畫有小分子毒素與蛋白質接合物,控制線畫有二級抗體會抓住抗體與奈米金粒子探針的接合物(圖二)。

其運作模式為當免疫層析試紙上的樣品層接觸到樣品溶液時,會依靠毛細作用經由樣品層往上牽引至釋放層,釋放層上的抗體與奈米金粒子探針接合物會藉由溶液的吸引力移至NC膜上,與測試線和控制線吸附物互相鍵結,吸水層之功能為加強毛細作用,使溶液中待測物能完全往上牽引,當樣品溶液中含有之小分子毒素超過一定量時,小分子毒素會佔據抗體的鍵結位置,因此抗體與奈米金粒子結合物便沒有足夠的鍵結位置能與測試線之小分子毒素結合,測試線就不會顯現紅線,呈現陽性反應;相反地,當樣品溶液中並未含有小分子毒素時,抗體與奈米金粒子接合物會鍵結到測試線小分子毒素上,進而產生紅線,呈現陰性反應(圖二)。控制線是用來確認免疫層析試紙是否正常運作,因此無論樣品溶液中有無小分子毒素,控制線部位皆會有紅線顯現。

圖三為利用免疫層析試紙檢測量穀物樣品中黃麴毒素B1的結果,樣品1-4號中黃麴毒素B1超過2 ng/mL (ppb)時,測試區紅線會消失,證實為陽性樣品。小分子層析試紙檢測使用競爭型方法,Sars-Cov2抗原快篩檢測核蛋白質或驗孕試紙檢測绒毛膜促性腺激素(HCG)蛋白質使用的則是雙抗體三明治法,因此小分子毒素層析試紙陽性結果判讀方法與驗孕試紙是剛好相反的。

3. 高效液相層析法(High performance liquid chromatography)進行小分子毒素分析確認

化學分析法如高效液相層析儀常被用來分析小分子毒素,其組成成份含有兩個高壓幫浦、自動或手動注射器、分離管柱、紫外光/可見光或螢光偵測器及電腦操控裝置。分析小分子毒素之高效液相層析法,其管柱之選擇通常以非極性之C18管柱為主,並結合紫外光/可見光或螢光偵測器進行檢測,原理為標準品或樣品溶液經過前處理及0.45 m過濾後,將樣品打入管柱,透過高壓幫浦將特定移動相溶液攜帶流經充滿固相 C18 填充物的管柱,而樣品裡的小分子毒素與管柱填充物的親和力不盡相同,因此樣品流經管柱後,與管柱(C18屬於非極性)親和力最小的極性化合物會先流出管柱;反之,與管柱親和力最大的非極性化合物會最後流出管柱,因而達到分離的效果,最後與毒素標準品進行比對,並經由專業人員的分析得知樣品中化合物的組成成份。

圖1:直接競爭型酵素免疫分析法反應步驟

圖2:小分子奈米金免疫層析試紙示意圖

圖3:利用免疫層析試紙分析樣品中小分子毒素,C為控制組; 1-4為陽性樣品,5-10為陰性樣品。

團隊簡介

計畫主持人

余豐益 教授, 中山醫學大學生物醫學科學系

計畫主持人自1992年前往美國威斯康辛大學─麥迪生分校攻讀食品微生物暨毒理學博士,開始從事小分子毒素抗體生產及免疫分析法之開發,原先在台大碩士班時的研究主題是有關愛文芒果的採收後處理,對於抗體生產的技術可以說是相當陌生,那時伏馬鐮孢毒素(fumonisin) 剛被發現不久,實驗室一直生產不出其專一性抗體,筆者幸運地在第一次將伏馬鐮孢毒素接合載體蛋白質來免疫兔子時,便成功地生產出專一性抗體,並且開發出非常靈敏之酵素免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),可以用來快速分析玉米汙染伏馬鐮孢毒素之情形,並且順利發表自己的第一篇SCI論文,雖然不是世界上第一位生產伏馬鐮孢毒素抗體的研究者,但是當時所建立之酵素免疫分析法之IC50,其靈敏度較第一位發表者提高了1000倍左右,隨後博士生涯中繼續生產了伏馬鐮孢毒素的單株抗體,anti-anti-idiotype單株抗體及伏馬鐮孢毒素單鏈抗體Single chain variable fragment, ScFv)並且於1997年取得博士學位。接著在UW-Madison完成為期一年的博士後訓練,也發表了多篇SCI 論文,於1998年應聘回台後,進入生物技術開發中心任職研究員,一年後旋即轉至中山醫學大學生物醫學系建立免疫化學暨食品安全快速檢測實驗室,二十多年來致力於小分子化合物及毒素之抗體生產與快速免疫檢測技術之開發,發表約50篇毒素檢測及毒理之SCI論文(http://w3.csmu.edu.tw/~fengyu/)。

與本技術相關之研發計畫
  • 科學園區生醫創新聚落整合推動計畫-109運用法人鏈結產學合作計畫(2020/1-2020/12)
  • 無酵素血糖、血球容積比、糖化血色素整合檢測平台開發(2020/8/1~2022/7/31)
  • 臺俄(RU)國合計畫-整合奈米電子、聲波電子、電化學技術之複合感測器研發及其在生物檢測之應用(2018.1-2020. 12)
團隊成員
  • 吳仕偉 博士候選人,中山醫學大學醫學研究所博士候選人
  • 鍾惟恆 專任碩士助理,中山醫學大學生醫系碩士
  • 林家君 兼任碩士助理,中山醫學大學生醫系碩士生
  • 蕭正浩 兼任大專生助理, 中山醫學大學生醫系大四生
  • 胡潔瑜 兼任大專生助理, 中山醫學大學生醫系大四生
技術合作聯絡人

吳仕偉
電話:04-24730022#11815
Email: shawn1024200288@gmail.com

吳亭萱
電話:04-24730022#11815
傳真:04-23248187
Email: ab118tw@gmail.com